导读
滨海与深海生态环境研究中心团队在Applied Energy上发表了题为：“Increasing temperature and sulfate enhances the efficiency of methane abatement in an anaerobic oxidation of methane bioreactor (AOMB) system” 的研究论文。该研究采用自主研制的甲烷厌氧氧化反应系统（AOMB）对深海冷泉沉积物进行长周期（230天）环境模拟培育实验，揭示了增加温度和硫酸盐浓度对甲烷厌氧氧化反应过程的影响，旨在探讨温度和基质可用性等环境因素调控下AOMB系统中甲烷消减效率的提升效果及其作用机制，进而为提高深海甲烷消减效率以及甲烷厌氧氧化反应体系的应用提供新的思路。
✦摘要✦
甲烷排放源的控制对于可持续的深海能源应用从而缓解甲烷引起的全球气候变暖非常重要。甲烷厌氧氧化（AOM）与硫酸盐还原（SR）的耦合反应在海底甲烷的生物过滤过程中起着关键作用。然而，AOM反应体系中甲烷消减效率的提高机制及其对温度和硫酸盐浓度的响应仍然未知。为了弥补这个知识差距，本研究采用自研AOMB系统进行深海冷泉沉积物的长周期培育（230天），并探究增加温度和硫酸盐浓度对系统内甲烷消减效果的影响及其作用机制。主要结论如下：（a）在温度升高（8至15°C）和硫酸盐添加（+15 mM）的条件下，AOM和SR的反应速率都显著升高。（b）硫酸盐和温度是影响古菌和细菌群落多样性的关键因素。（c）ANME-2c、ANME-1b、SEEP-SRB1和Halodesulfovibrio是该系统中甲烷-硫循环的优势属。（d）功能基因预测表明，甲烷氧化与异化硫酸盐还原的耦合作用是甲烷消减的原因。本研究结果为提高深海甲烷消减效率和AOM反应体系的应用提供了新的思路。
✦引言✦
在能源应用领域，维持能源使用与环境负面影响的平衡是一个普遍的认识。甲烷是一种常用的能源，其在深海中储藏丰富。陆地能源的逐渐枯竭刺激了人类对深海油气资源的勘探和开发。这些深海作业不可避免地改变了水合物储层并导致甲烷泄漏，随后由于甲烷的变暖效应更大而加剧了全球变暖。
以往的研究人员致力于探索措施和工具以控制由于深海能源开采所产生的海底甲烷排放源，从而减缓大规模甲烷释放和全球气候变暖，其中，甲烷生物过滤是一种可减缓甲烷释放的环保和有效的方法。首先，对甲烷释放引起的全球变暖潜能值进行科学评估是基础。由于深海油气资源的开采不当，海底出现了新的甲烷排放源，而缺乏相应的甲烷消耗机制，这是造成甲烷排放量大幅增加的原因。其次，找到生物过滤的主要参与者及其功能是主要途径。在厌氧海洋环境中，甲烷厌氧氧化（AOM）是甲烷消耗的天然屏障，可防止高达90%的甲烷向上排放到水圈中。厌氧甲烷氧化古菌（ANME）与硫酸盐还原细菌（SRB）偶联并介导硫酸盐还原，甲烷通过硫酸盐还原作用被氧化。由于海水中富含硫酸盐电子受体，甲烷厌氧氧化与硫酸盐还原的耦合作用（AOM-SR）被认为是海底甲烷消耗的主要过程。然而，不同环境条件影响AOM-SR反应过程的机制尚不清楚。此外，生物反应器最近还被用于实现基于AOM反应的甲烷生物过滤过程。近年来，由于深海技术的发展，科学家使用高压生物反应器模拟了深海环境并探索了AOM反应速率。然而，由于ANME生长速度缓慢（2-7个月倍增时间），ANME的纯培养物在世界范围内仍然未能获取。经过数年培育实验的努力，科学家利用所获得的高纯度ANME培养物以探索其甲烷氧化特性。此外，系统设定的环境参数对甲烷氧化性能的影响也起着重要作用。
然而，温度和基质可用性等环境因素调控对提高甲烷消减效果的影响和机制尚不清楚。
本研究旨在探讨环境调控下AOMB系统甲烷消减效能的提升效果及其作用机制。具体而言，其分为三个部分：（a）通过定期监测甲烷和硫酸盐反应物以及二氧化碳和硫化物产物的浓度变化，表征系统中AOM和SR反应的动力学特征;（b）追踪古菌和细菌对温度升高和硫酸盐的反应动态，确定AOM-SR反应的关键环境因素;（c）预测参与甲烷和硫循环的关键基因，阐明调节甲烷消减系统效能的潜在机制。
本研究将为生态友好型的甲烷消减提供创新的视角。
成果简介
01 AOMB系统中的甲烷消耗特性
在C1和 C2 阶段（8 °C），在顶空、海水和沉积物三个层面上都观察到甲烷减少，而二氧化碳的产生缓慢（图1）。系统加入 15 mM 硫酸盐后，其甲烷减少的幅度变大，硫酸盐消耗量和硫化物产生量也略微增加。在系统升温后（H1和H2阶段），甲烷和硫酸盐反应物的消耗量以及二氧化碳和硫化物产物的产生量都大于低温条件（C1和C2阶段）。系统在升温之后，AOM过程显得更加活跃，15°C的条件下更适合AOM反应。
Fig. 1. The AOM process under the conditions of increasing temperature and sulfate concentration in the AOMB system of headspace layer (a), seawater layer (b), and sediment layer (c). Indicators of the AOM process includes reactants of methane (blue) and sulfate (green) and products of carbon dioxide (red) and sulfide (yellow).
系统的反应速率如图2所示。在15°C的条件与8°C相比，顶空层、海水层及沉积物层的AOM和SR速率都显著升高。顶空层的甲烷含量变化代表了系统内的整体甲烷消耗率。因此，系统在15°C下的AOM速率范围为13.7−18.5 mM/d，与8°C条件下相比高出30.1−63.72%。硫酸盐的添加导致系统在两种温度条件（C2和H2 阶段）下都能显着提高 SR 速率。特别是在15°C且添加硫酸盐的条件下，SR速率在海水中高达0.34 mM/d，在沉积物中高达4.95 mM/d；与8°C的条件相比，SR速率在海水中增强了1.66−2.3倍，在沉积物中增强了1.81−1.96倍。相比之下，硫酸盐的添加对AOM速率的增强作用相对较弱，两组之间的速率值相似。由于该处理的AOM速率与SR速率没有以1：1相匹配，因此当硫酸盐浓度升高时，系统中的AOM-SR反应可能发生解耦效应。系统中作为电子受体或供体的大量硫酸盐可能促进了硫循环。
Fig. 2. AOM rate in the AOMB system of headspace layer (a), seawater layer (b), and sediment layer (d) as well as SR rate in the seawater layer (c), and sediment layer (e). The square, circle, triangular and inverted-triangular shape in the figure represent the group C1, C2, H1, and H2, respectively.
在海洋沉积物-水界面的电子受体中硫酸盐总浓度最高，因此AOM-SR被认为是该环境中的主导作用。对于AOMB系统的连续运行，定期监测反应物和产物浓度，例如CH4、CO2、SO42−和S2−等指标，以识别系统内的反应动力学。系统温度的适当升高可有效提高AOMB系统的甲烷消减效率，其温度调节应基于系统内主要微生物类群的适应性。此外，作为AOM-SR电子受体的硫酸盐基质需要定期补充，以保持系统运行效率。在高甲烷分压下，大量的甲烷结合不断补充的硫酸盐，推动了AOM-SR反应，从而增强了甲烷氧化的系统性能。另一方面，充足的硫酸盐输入和温度升高改变了系统的生态平衡。系统中的群落组成随着新条件的变化而变化。虽然ANME与SRB介导的AOM-SR反应是该系统的主要过程，但微生物群落结构和生态过程在该系统中的作用值得进一步研究。
本研究对深海环境过程的模拟和调控提供了重要参考。总的来说，温度升高会显著提高AOM-SR速率，从而增强甲烷消减效果。升温措施为深海原位甲烷消减提供了潜在的应用。在未来的深海能源开发中，在海底部署原位控温装置可被作为提高当地AOM-SR速率的措施，从而避免由于产生新的甲烷渗漏而将甲烷大量释放到海水中。因此，采取有效的风险防范措施对于加强深海能源开发的生态安全至关重要。
02 AOMB系统中的微生物群落结构
为了研究AOMB系统中微生物群落结构的动态，探究了古菌和细菌在各周期响应前后在门水平上的分布（图3）。在细菌门类群中，Desulfobacterota在硫酸盐添加后一直以较高的相对丰度（~50%）占主导地位，其在系统中的硫酸盐还原中起着重要作用。在整个培育期内， Halobacterota在古菌门类群中占很大比例（>90%），其在适宜的环境温度下持续富集，并在甲烷代谢中起着重要作用。经过四个培育阶段（230天），Halobacterota的相对丰度从91%增加到97%，而Desulfobacterota的相对丰度在40%-75%之间变化。
Fig. 3. Archaea (a) and bacteria (b) community compositions at the phylum level.
ANME-2c、ANME-1b、SEEP-SRB1和Halodesulfovibrio属是AOMB系统中的优势类群（图6）。由于系统升温，ANME-2c的相对丰度增加了20.84%，Halodesulfovibrio的相对丰度增加了15.93%。在15°C下，ANME-1b在硫酸盐添加后的相对丰度增加了13.08%。在8°C下， SEEP-SRB1在硫酸盐添加后的相对丰度增加了15.04%。这些属可能在AOM-SR过程中发挥关键作用。其中，氟去磺酸盐可以与硫酸盐、亚硫酸盐和硫代硫酸盐一起生长为电子受体，并可以驱动AOM-SR反应。系统在升温后，ANME-1b和SEEP-SRB1的相对丰度降低，而ANME-2c和Halodesulfovibrio的相对丰度增加。在原位环境中，ANME-2分支（2a、2b和2c）存在于不同冷泉沉积物的甲烷-硫酸盐转换带（SMTZ）中，其生境范围较大（4−20°C）。硫酸盐的添加抑制了Halodesulfovibrio的生长，而促进了ANME-2c，SEEP-SRB1的生长。ANME-2c和SEEP-SRB1的聚集体通常在高硫酸盐通量的海底表层沉积物中被发现。
在AOMB体系中，AOM-SR功能物种富集纯度对甲烷消减效果的提高起着重要作用。在接种之前，应最大限度地提高ANME富集物的纯度，以达到最高的甲烷氧化性能，尽管由于ANME生长缓慢和富集技术挑战，全球范围内仍未对ANME进行纯培养物筛选。此外，还需要根据特定功能类群（如ANME-2c）所适应的环境温度来调节系统温度。需要寻找ANME和SRB的适宜温度区间，以便它们进行有效的耦合作用，并且它们的聚集体表现出最佳活性。适当调整硫酸盐底物浓度，以防止过量硫酸盐导致AOM-SR的解偶效应以及ANME的同化还原。因此，在刺激硫酸盐还原的同时加强AOM-SR偶联作用是实现系统中甲烷消减效率最大化的关键。
03 微生物群落、AOM活性和环境因素之间的联系
为了探究影响微生物群落组成的关键地球化学变量，通过RDA分析和置换检验评估群落多样性与环境变量之间的相关性（图4）。结果表明，关键地球化学参数包括温度、压力、pH值、CH4、CO2、SO42−、S2−、TOC、DIC、Ca、Mg、Fe和Mn等对于解释微生物群落的方差具有统计学意义（p<0.05）。这些变量分别占古菌和细菌群落中解释方差的44.19%和38.56%。更重要的是，温度和硫酸盐都是古菌和细菌群落最重要的解释变量（p<0.001），这与系统的实验条件密切相关。事实上，硫酸盐在添加后系统大量积累使得SR成为主要的末端电子接受过程。值得注意的是，低温（8°C）条件下的群落与硫酸盐和温度变量的相关性最大，表明群落在低温下更容易受到这两个因素的影响。高温（15°C）条件下的群落则与其他多种变量相关，表明群落在高温下受到多种环境因子的调控。此外，介导AOM-SR过程的特征属，如ANME-2c、SEEP-SRB1和Sulfurovum，与硫酸盐和温度变量表现出很强的相关性。因此，温度和硫酸盐是影响AOMB系统中古菌和细菌群落结构的关键环境因素。
Fig. 4. Redundancy analysis (RDA) correlating the geochemical variables to archaeal (a) and bacterial (b) communities of samples as well as main archaeal (c) and bacterial (d) genera. The yellow, dark-yellow, blue, and dark-blue dots in the figure represent the group C1, C2, H1, and H2, respectively. The red dots indicate the main genera, and their sizes represent their abundance. The pink arrows indicated individual geochemical parameters. Significance levels (marked by asterisks) were based on the permutation test. ***p < 0.001; **p < 0.01; *p < 0.05.
此外，图7显示了与AOM反应相关的环境因素的响应特性。与C2、H1和H2的阶段相比，在低硫酸盐浓度下，C1阶段系统的Fe和Mn浓度下降幅度更大。Fe和Mn的响应与前人研究一致，AOM与金属还原的耦合反应一般发生在低硫酸盐环境中。在15°C条件下，系统中Ca和Mg元素含量相比8°C条件下降得更多。当系统达到较高的AOM-SR反应速率时，可能会发生矿物沉淀，如碳酸盐和高镁方解石。同时，在高AOM-SR速率的H1和H2阶段，系统中的DIC含量显著增加。此外，高AOM-SR速率也导致体系中TOC含量增加，这可归因于反应产生的大量有机中间体，如甲酸和乙酸。
本研究显示，AOM-SR功能群落对于硫酸盐和温度关键环境因素具有敏感性。运行初始时，原位获取的沉积物从低温环境转移到AOMB系统。系统可在逐渐升温的同时适当添加硫酸盐以激活这些富集物从而提高系统性能。当系统升温时，甲烷氧化活性会达到较高水平，但仍应注意各种环境参数的调节，如压力、pH值、CH4、CO2、SO42−、S2−、TOC、DIC、Ca、Mg、Fe和Mn等，以避免反应活性受到它们的干扰。特别是pH值、DIC、CO2和S2−等指标的增加，这代表了系统中产物的大量积累。碱度和硫化氢产物浓度的升高对于介导AOM-SR过程的微生物具有生长抑制性甚至细胞毒性。因此，当AOMB系统长期运行时，需要适当调整环境敏感性因子以提高AOM-SR活性，从而提升系统的甲烷消减效率。
Fig. 5. Heatmaps based on the 10 topmost abundant genera of archaea (a) and bacteria (b) at the four groups, including signature microbes associated with biological carbon and sulfur cycling.
Fig. 6. The functional genes involved in biological carbon (a) and sulfur cycling (b) as predicted by PICRUSt2 based on KEGG category.
Fig. 7. The variations of environmental factors of Mg, Ca, Fe, and Mn during the 4 phases of C1, C2, H1, and H2 in the AOMB system of seawater layer (a) and sediment layer (c). The variations of TOC and DIC during the 4 phases in the AOMB system of seawater layer (b) and sediment layer (d).
04 甲烷和硫循环的功能属和关键基因
考虑到AOMB系统的性能最终是由不同功能的古菌和细菌决定的，因此有必要分析功能属的结构和功能关系。在这项研究中，使用KEGG数据库手动检索了与甲烷和硫循环相关的功能基因。选取甲烷氧化、甲烷生成、同化硫酸盐还原、异化硫酸盐还原和硫氧化等代谢途径，探究甲烷代谢古菌和硫代谢细菌的动力学。通过PICRUSt2预测这些微生物功能基因的相对丰度发现，由于系统升温，甲烷代谢基因和硫代谢基因的相对丰度分别增加了19.72%和15.8%（图6）。在15°C和硫酸盐添加的条件下，甲烷代谢基因的相对丰度降低了12%，而硫代谢基因的相对丰度增加了13.43%。在参与甲烷氧化的基因中，mdh基因（mdh1和mdh2）在所有阶段的预测丰度最高（40.5%）。在整个潜伏期内，产甲烷途径中主要基因（如mtr、mch、mer、fwdA和ftr）的总相对丰度（53%）也较高。这表明系统中的甲烷代谢过程可能是甲烷氧化与甲烷生成共存，这是因为产甲烷菌中负责甲烷产生的碳代谢关键酶也存在于ANME中。甲烷通过ANME中产甲烷酶的代谢途径被氧化，这类酶是一种反向的作用机制，例如CO2还原至CH4的逆向作用，但这类酶仍未被很好地表征。值得注意的是，与异化硫酸盐还原和氧化相关的基因（如sat、dsr和apr）的预测丰度在整个实验阶段均占主导地位，并且其基因丰度在硫酸盐添加条件下（C2和H2阶段）相对较高。结果表明，系统中的硫代谢过程以异化硫酸盐还原为主，异化硫酸盐还原和AOM的协同代谢构成了AOM-SR过程。因此，系统中的生态策略与环境条件的调节密切相关。然而，微生物功能类群响应关键环境因素的分子机制仍需通过采用基于RNA和蛋白质水平的宏转录组学和宏蛋白组学方法进一步研究。
基于微生物功能类群的基因丰度预测是一种快速、低成本的微生物动力学分析工具，它可以为确定系统中的反应过程提供参考点。根据甲烷和硫循环代谢途径中预测的基因丰度，定期监测系统中与AOM-SR反应相关的甲烷代谢细菌和硫代谢细菌的动力学。基因水平上的监测可获得系统中的主要响应特征。经过长时间运行后，系统中可能会发生产甲烷等逆向反应，进而阻碍系统的甲烷消耗。根据基因数据，可以对系统的培养物进行所需功能类群的接种，以促进甲烷氧化方向上的反应过程。对于接种的特征功能微生物，还需要调整系统的环境参数，以增强对新成员的适应性，从而恢复或增强系统甲烷消减的性能。
结论与展望
本研究采用自研AOMB系统在增加温度和硫酸盐浓度的条件下进行了为期230 天的AOM-SR生物反应实验，提高了该系统的甲烷消减效率。本研究为环境参数调控下甲烷消减效能的提升和AOM反应体系的应用提供了重要见解。其主要结论如下：
（a）15°C条件下系统中的AOM速率高达13.7–18.5 mM/d，与8°C条件下相比显著增加30.1–63.72%。与8°C条件相比，15°C条件下硫酸盐添加对SR速率的增强效应在海水中为1.66–2.3倍，在沉积物中为1.81–1.96倍。
（b）硫酸盐和温度显著影响古菌和细菌群落多样性。甲烷-硫循环功能属，如ANME-2c、ANME-1b、SEEP-SRB1和Halodesulfovibrio，是AOMB系统中的优势类群，在整个试验期间保持较高的相对丰度。
（c）系统中mdh、sat和dsr等功能基因的预测表明，甲烷氧化和异化硫酸盐还原的耦合作用是该系统甲烷消减的原因。
进一步地，未来的研究将聚焦AOMB系统在长期运行中的稳定性和可持续性、ANME培养物纯度以及多因素调控下AOM-SR反应的速率提高。
原文信息
Liang, J., Feng, J.-C., Chen, X., Li, C. and Zhang, S. (2024) Increasing temperature and sulfate enhances the efficiency of methane abatement in an anaerobic oxidation of methane bioreactor (AOMB) system. Applied Energy 362, 122979.
